Western轉印的優化

從SDS凝膠中進行Western蛋白轉印的優化需要對一系列參數進行考慮。目的是轉印所有凝膠上的蛋白并將其定量地轉移到轉印膜上。進行轉印需要一定程度的優化，尤其是對于大分子量和小分子量蛋白。

轉印后，凝膠上應不殘留或殘留很少的蛋白?？梢栽谵D印后進行染色進行檢測。轉移出凝膠的蛋白應該僅在接觸凝膠的膜的一面可見。如果有懷疑，在轉印時使用第二個"支持膜"，你可以在轉膜后染色，以檢查是否有穿膜的跡象。如果發現蛋白殘留在凝膠上而且膜的結合性很差，可以考慮下列因素：

凝膠濃度

丙烯酰胺濃度越低，蛋白越容易轉移下來。選擇可以分離蛋白的濃度zui低的凝膠。梯度膠適用于轉印一系列不同大小的蛋白，因為凝膠的孔與不同大小的蛋白匹配良好。

凝膠厚度

蛋白比較易于從薄膠上轉移下來，所以上樣體積允許，使用1.0mm厚的膠取代1.5mm的膠。

電場（電壓×時間）

如果電壓過低而且轉印時間過短，部分蛋白會殘留在凝膠上。如果電壓過高，小蛋白會在結合到膜上前透膜而出。如果按建議的條件轉印后有蛋白殘留在膠上，增加電壓可能會有幫助，但不要超過5V。但注意，一旦SDS從蛋白剝離，增加轉印時間或提高電壓就無效果。一旦結合，即使延長轉印時間，大部分蛋白也會保持在膜上。

SDS vs 酒精

在多數轉印實驗步驟中都使用SDS和酒精。但兩者對于成功的轉印有相反的作用，需要根據欲轉印蛋白的性質加以優化。

SDS對于蛋白的遷移是必要的，尤其有助于大分子量蛋白從凝膠上的轉移。但由于膜結合需要疏水相互作用，SDS過多會抑制結合，尤其對于NC膜。如果從蛋白上剝離太多SDS，將無法將蛋白轉移出膜。作為一個一般性的規則，如果膜的結合力有效，但蛋白仍舊殘留在凝膠上，在轉印緩沖液中加入 0.01％會促進*轉印。建議的步驟在轉印緩沖液中不含有SDS，但凝膠在電泳后不需要浸泡在轉印緩沖液中；凝膠中殘留的SDS對于有效的轉印已經足夠。但另一方面，酒精通過在蛋白上剝離SDS促進蛋白和膜的疏水接合。一般在轉印緩沖液中加入20％的甲醇會增加NC膜的接合能力。

膜的類型

結合到NC膜（WHATMAN NC膜30cm*3m/0.22um和WHATMAN NC膜30cm*3m/0.45um）上主要通過疏水鍵。NC膜對于常規使用非常好。對于小的多肽，建議使用小口徑的膜。

PVDF膜（Millipore PVDF膜26.5cm*375cm/0.22um和Millipore PVDF膜26.5cm*375cm/0.45um）比NC膜更疏水，在轉印過程中結合蛋白更緊密，可以耐受更多的SDS。目前，PVDF一般比NC膜需要更嚴謹的封閉條件。其適用于蛋白測序。

尼龍膜（Amersham帶正電荷尼龍膜RPN303B/30cm*3m，0.45um）通過疏水和靜電相互作用結合。其SDS耐受度甚至高于PVDF，但也需要更嚴謹的封閉條件。主要建議用于Northern和Southern。

做一塊凝膠的轉印

1. 在電泳后，將切膠刀的斜邊楔入膠盒兩塊板之間的縫隙中，撬開每邊的三個粘合點。膠盒的凹口（加樣孔）面應面向上。在刀柄上來回推動以分離膠板。在膠盒的各邊緣重復直至膠板*分離。當將切膠刀插入到兩塊膠板之間時必需小心，以免對凝膠壓力過大。
2. 當打開膠盒時，凝膠會粘附在膠盒的一邊。小心移除無凝膠的膠板，使凝膠留存在另一塊膠板上。用切膠刀切除加樣孔。
3. 將一片預先浸泡過的濾紙放在凝膠頂部，剛好在凝膠底部的"底腳"的上部（不覆蓋凝膠的底腳）。使用轉印緩沖液持續飽和濾紙，確保趕走了進入的氣泡?？梢允褂貌Ａб埔汗茏鳛闈L筒，輕輕在表面滾動，從而很容易做到這點。
4. 將膠盒翻轉，使凝膠和濾紙面向下放置在戴手套的手掌上或者放有一片Parafilm?膜的干凈平面上。使用下面的一種方法將凝膠從膠板上分離：
a） 如果凝膠在較長（有狹縫）的膠板上，用切膠刀通過膠盒上的狹縫輕推底部，凝膠將很容易從膠板分離。
b） 如果凝膠在較短（有凹口）的膠板上，使用切膠刀小心松凝膠的底部，使凝膠從膠板滑離。
5. 放置到平面上后，使用切膠刀切掉凝膠的"底腳"。
6. 使用轉印緩沖液潤濕凝膠，將預先浸泡過的轉印膜放在凝膠上。確保趕凈氣泡。
7. 將預先浸泡過的陽極側的濾紙放置在凝膠上，確保除去進入的氣泡。
8. 將預先浸泡過的轉印墊放入轉印模塊的陰極核心。陰極核心是兩塊核心中較深的一邊，其電極板為暗灰色。小心取出凝膠和膜的組裝體，按同樣順序放在轉印墊上，使凝膠距離陰極zui近（圖2）。
9. 加入足夠的預先浸泡過的轉印墊，使其比陰極核心的邊緣高出0.5cm。將陽極核心放在轉印墊的上面。凝膠/膜組裝體應可以穩固在轉印模塊的兩半部分之間，以確保所有組件*接觸。因為轉印墊使用多次后會失去彈性，所以可能需要多一塊轉印墊以確保轉印模塊的兩邊*組合。當轉印墊脫色并開始失去彈性時應進行更換。
10. 將轉印模塊緊緊按在一起，沿滑軌放入電泳槽中。轉印模塊只能以一種方式進入，所以可以在轉印模塊的左上角看到陽極標志。如果放置正確，轉印模塊右手邊倒置的黃金柱電極正好插入電泳槽右上方黃金柱電極近鄰的孔中。
11. a） 對于Xcell SureLock?:放入張力楔（tension wedge），其垂直面頂住轉印模塊， 將凸柄前壓，鎖定電泳槽。
b） 對于Xcell Ⅱ? Mini-Cell：放置前楔（無螺孔），其垂直面頂住轉印模塊，將后楔滑入，向后推緊。如果放置正確，后楔將不會和電泳槽上沿平齊。在后楔和電泳槽之間會有一個狹縫。
12. 在轉印模塊中倒入轉印緩沖液直至凝膠/膜復合層被轉印緩沖液覆蓋。不要將液面至頂，這只會增加導電性和熱量。
13. 通過電泳槽前端和轉印模塊前端的縫隙在外槽中加入650ml去離子水。水面距離電泳槽上沿大概2cm。這是用于運行過程中的散熱。
14. 在上面放上蓋子
15. 在電源關閉情況下，將紅色和黑色導線插入電源。

做兩塊凝膠的轉印

1. 重復步驟1-6 兩次，制作兩個凝膠-膜組裝體。
2. 將兩個預浸泡過的轉印墊放在轉印模塊的陰極外殼上。將*個凝膠-膜組裝體按正確的方向放在轉印墊上，使凝膠離陰極板zui近。
3. 將另一塊預浸泡過的轉印墊放在*塊膜復合體上。
4. 將第二個凝膠-膜組裝體按正確的方向放在轉印墊上，使凝膠離陰極板zui近。
5. 進行"轉印一塊凝膠"中的8-13步。